便利なリアルタイム PCR 装置の最適化

ウイルス定量および SNP ジェノタイピングのためのリアルタイム蛍光定量 PCR の場合、可能な限り高い特異性を備えた PCR 装置が必要です。病原体やmRNAの検出であれば高感度が必要 PCR装置では、この PCR 装置をどのように最適化すればよいでしょうか?

コンテンツリストは次のとおりです。

l PCR装置の増幅効率の向上

l 一般的な PCR にリアルタイム PCR 装置のプライマーを使用する

PCR装置の増幅効率の向上

改善するには PCR装置 増幅効率、特異性、感度を向上させるため、一連の対策を通じて実験用のリアルタイム蛍光定量 PCR 装置を最適化できます。 1 つ目はターゲット配列の選択です。

1、便利なリアルタイム PCR マシンのターゲット配列の選択は、50 ～ 150 bp の間の適切な長さです。配列が短いほど合成にかかる時間が短くなり、増幅時間が短いため、増幅される汚染 DNA の可能性が低くなります。

2. ターゲット配列を選択するときは、BLAST 検索を使用してターゲット配列の多型および配列エラーを分析し、それらを回避します。ターゲット配列に重複配列がある場合、この PCR 装置の検出感度が低下するため、これも避けるべきです。

3、ターゲット シーケンス内の GC 含有量を ≤ 60% に制御します。 GC 含有量が高いと、熱サイクルでのターゲット配列の変性が影響を受けますが、この PCR マシンによる非特異的増幅も容易に生じます。

4、二次構造の生成を避ける。逆反復配列を持つターゲット配列は二次構造を生成しやすく、便利なリアルタイム PCR 装置のプライマーやプローブのハイブリダイゼーションに影響を与えます。

これに加えて、テンプレートの品質が増幅に影響を与えないこと、便利なリアルタイム PCR 装置の結果に信頼性があることを確認する必要もあります。たとえば、損傷した DNA は PCR 装置で適切に増幅できないか、まったく増幅されません。また、テンプレート内の DNA ポリメラーゼ阻害試薬 (DMSO など) や汚染物質 (SDS など) の存在は、PCR 装置の増幅結果の信頼性に影響を与える可能性があります。

一般的な PCR にリアルタイム PCR 装置のプライマーを使用する

便利なリアルタイムを手に入れる PCR装置 この方法は通常のPCRでも使用できます。

1. 結合の特異性を確保するには、長さが 18 ～ 30 bp である必要があります。

2. 融解温度 (Tm 値) は 55 ～ 60°C である必要があり、2 つのプライマーの Tm 値は 2 ～ 3°C 異なる必要があります。

3. 各プライマーは 3' 末端に 1 ～ 3 個のグアニンまたはシトシンを持つ必要があります。これにより、リアルタイムでの PCR 装置中の非特異的増幅を都合よく減らすことができます。 3 つを超えると逆効果となり、「スライディング効果」が発生し、間違った拡張につながる可能性があります。

4. プライマーの GC 含有量は約 50% である必要があります。GC 含有量が高すぎると Tm 値が増加します。

5、PCR マシンのプライマーは、二次構造を形成し、テンプレート上のプライマー結合に影響を与えるため、逆反復配列を避ける必要があります。

6. RT-PCR の場合は、PCR マシンの実験結果が偽陽性になる可能性がある、エキソン配列に結合するプライマーの設計も避ける必要があります。正しいアプローチは、長いイントロンの側面、短いイントロン、またはエクソン-エクソン接合領域全体に対して設計される必要があります。

7. プライマーの脱塩と精製。

すべてのポイントを完了しても、プライマーが増幅しない場合があるため、プライマーを再設計する必要があることに注意してください。

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